1941年1月4日，皖南新四军军部直属部队等9千余人，在叶挺、项英率领下开始北移。1月6日，当部队到达皖南泾县茂林地区时，遭到国民党7个师约8万人的突然袭击。新四军英勇抗击，激战7昼夜，终因众寡悬殊, 弹尽粮绝，除傅秋涛率2000余人分散突围外，少数被俘，大部壮烈牺牲。军长叶挺被俘，副军长项英、参谋长周子昆突围后遇难，政治部主任袁国平牺牲。这就是震惊中外的“皖南事变”。
虽然限制中共的发展是蒋介石一以贯之、梦寐以求的目标，但对于消灭新四军，他的态度应该说是犹豫不决的。对于发动“皖南事变”，他的内心里又不是太有底气。
发动“皖南事变”前，蒋介石的内心深处是紧张、压抑的。事变发生之后，由于消灭了新四军军部，蒋介石因尝到一丝“甜头”而感到暂时的欣喜。然而，短暂欢愉之后，等待蒋介石的更多是苦头。
“皖南事变”发生后，蒋介石经过反复权衡，抱持不扩大事态的态度，将这一事变定性为整饬军纪，只针对华中新四军，而不牵涉华北的八路军和中共整体。然而对这一事件的真正性质，蒋介石和中共领导层彼此均心知肚明。蒋介石认为此事的影响有过于1926年3月发生的中山舰事件。中共方面则认为此事是“七七抗战以来国民党第一次重大政治变化的表现”，有可能成为“四一二”政变的翻版。
“皖南事变”后，中共方面在吸取第一次国共合作失败教训的基础上，从抗战形势及当时国共实力对比态势出发，改变事变爆发之初“政治上军事上迅即准备作全面大反攻，救援新四军，粉碎反共高潮”的决定，转而采取政治上取猛烈攻势、军事上暂时取守势的斗争策略。不仅很快重建新四军军部，还提出12条要求，与国民党激烈交锋。
国际上，苏联、美国纷纷过问此事，使得蒋介石面临巨大的内外压力。前苏联外交部、前苏联驻华大使潘友新、前苏联驻华武官崔可夫等人纷纷面见蒋介石询问事变详情。蒋介石虽然“义正辞严”地予以回复，但他毕竟心里没底。为了缓和与苏联的关系，他不得不特地放下架子，“打破不到外国大使馆”的惯例，亲自赴苏联大使馆参加庆祝红军建军的活动。令蒋介石始料不及的是，美国方面也对中共极表同情。罗斯福总统派秘书居里赴华实地考察。为防止中国重新陷入内战而无法牵制日军南进，美国明确反对国民党意在消灭八路军、新四军的内战行为。
可以说，“皖南事变”的结果对于蒋介石、国民党而言，无疑得不偿失，从战略角度看可以说是完全失败的。尽管蒋介石在口头上不愿意承认失败，但他也不得不哀叹从此中共已成无法就范之势。